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PCR實驗室的基本設備與要求(全文完整版)

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PCR實驗室的基本設備與要求(全文完整版)

臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法

第一章  總則
第一條 為規范臨床基因擴增檢驗實驗室管理,保證臨床基因擴增檢驗質量,使臨床診斷和治療更為科學、合理,特制定本辦法。
第二條 臨床基因擴增檢驗技術指以臨床診斷治療為目的,以擴增檢測DNA或RNA為方法的檢測技術,如聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、轉錄依賴的放大系統(TAS)自主序列復制系統(3SR)和鏈替代擴增(SDA)等。
第三條 本辦法適用于開展臨床基因擴增檢驗的實驗室。臨床基因擴增檢驗實驗室設立在二級以上醫院。
第四條 臨床基因擴增檢驗實驗室必須使用經國家藥品監督管理局批準的臨床檢驗試劑開展臨床基因擴增檢驗項目。
第五條 衛生部臨床檢驗中心(以下簡稱衛生部臨檢中心)和省、自治區、直轄市臨床檢驗中心(以下簡稱省臨檢中心)負責對所轄行政區域內臨床基因擴增檢驗實驗室的質量監督管理工作。


第二章  實驗室設置和驗收
第六條 擬設置臨床基因擴增檢驗實驗室的醫療機構按照《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》(見附件)籌建實驗室;籌建完成后,由法定代表人向衛生部臨檢中心提出技術驗收申請。申請時需提交以下材料:
(一)《醫療機構執業許可證》復印件;
(二)可行性研究報告;
1、擬設臨床基因擴增檢驗實驗室機構的所在地醫療衛生資源狀況、本機構的基本情況、對臨床基因擴增檢驗的需求以及臨床基因擴增實驗室運行的預測分析;
2、擬設臨床基因擴增檢驗實驗室的設置平面圖;
3、擬設臨床基因擴增檢驗實驗室將開展的檢驗項目、實驗設備條件和有關技術人員資料
第七條 衛生部臨檢中心和省臨檢中心共同組織相關專業的專家組(以下簡稱專家組),按照《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》對提出申請的臨床基因擴增檢驗實驗室進行技術驗收。驗收完成后,在20日內將驗收報告寄送至申請機構。
第八條 經專家組技術驗收合格的醫療機構將本辦法第六條規定的材料及專家組驗收報告送至省級行政部備案。在將符合規定的全部材料送達省級衛生行政部門后15日內未收到省級衛生行政部門不同意的意見,方可開展專家組技術驗收合格的臨床基因擴增檢驗項目。
第九條 未經專家組驗收合格并報省級衛生行政部門備案的醫療機構不得擅自開展臨床基因擴增檢驗項目。

第三章  實驗室監督管理
第十條 臨床基因檢驗實驗室必須按照《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規范》(另發)開展臨床基因擴增檢驗工作。
第十一條 臨床基因擴增檢驗實驗室技術人員必須進行上崗培訓。經培訓合格者,由培訓單位發給合格證書,并將培訓合格人員名單報衛生部臨檢中心備案。獲得培訓合格證書者方可從事臨床基因擴增檢驗工作。
培訓單位為衛生部臨檢中心,或由省級衛生行政部門指定并經衛生部臨檢中心認定的機構。培訓時使用規定的統一教材。
第十二條 以科研為目的的基因擴增檢驗項目。不得向臨床出具檢驗報告,不得向病人收取任何費用。
第十三條 臨床基因擴增檢驗實驗室必須按照《臨床基因擴增實驗室工作規范》開展室內質量控制,并參加衛生部臨檢中心組織的室內質量評價。
第十四條 衛生部臨檢中心按照本方法和《臨床基因擴增實驗室工作規范》協調、組織省臨檢中心對臨床基因擴增檢驗實驗室的檢驗質量進行監測。監測結果報省級衛生行政部門,同時抄送被監測的臨床基因擴增檢驗實驗室所在醫療機構。
第十五條 衛生部臨檢中心或省級臨檢中心受省級以上衛生行政部門委托可對臨床基因擴增檢驗實驗室進行現場檢查,現場檢查工作人員在履行職責時應出示證件。在進行現場檢查時,檢查人員有權調閱有關資料,被檢查機構不得拒絕或隱瞞。
第十六條 衛生部臨檢中心對在室間質量評價中不合格的臨床基因擴增檢驗實驗室提出警告,對連續二次或三次中有二次發現臨床基因擴增檢驗結果不合格的臨床基因擴增檢驗實驗室,衛生部臨檢中心報省級以上衛生行政部門由省級以上衛生行政部門責令其暫停有關臨床基因擴增檢驗項目,限期整改。經專家組進行再次技術驗收并合格,并報省級衛生行政部門核準后,方可重新開展臨床基因擴增檢驗項目。
第十七條 對于未經衛生部臨檢中心組織的專家組技術驗收合格并報省級衛生部門備案,擅自開展臨床基因檢驗項目的醫療機構,由省級衛生行政部門依據《醫療機構管理條例》第四十七條和《醫療機構管理條例實施細則》第八十條予以處罰,并予以公告。公告所需費用由被公告機構支付。
第十八條 出現下列情況之一的臨床基因擴增檢驗實驗室,由省級衛生行政部門責令其停止開展臨床基因擴增檢驗,并對其所在醫療機構予以公告。公告所需費用由被公告機構支付:
(一)開展超出衛生部臨檢中心組織的技術驗收合格并報省級衛生行政部門備案臨床基因擴增檢驗項目的;
(二)使用未經國家藥品監督管理局批準的試劑開展臨床基因擴增檢驗的;
(三)在臨床基因擴增檢驗中未開展室內質量控制的;
(四)在臨床基因擴增檢驗中未參加室間質量評價的;
(五)在臨床基因擴增檢驗中弄虛作假的;
(六)以科研為目的的基因擴增檢驗項目向病人收取費用的;
(七)使用未經培訓合格的專業技術人員從事臨床基因擴增檢驗的;


第四章  附則
第十九條 對采供血機構的基因擴增檢驗實驗室開展基因擴增檢驗項目的管理,參照本辦法執行。
第二十條 衛生部臨檢中心組織的專家組對申請開展臨床基因擴增檢驗的實驗室進行技術驗收所需費用按國家有關規定執行。
第二十一條 本辦法由衛生部負責解釋。
第二十二條 本辦法自發布之日起施行。
附:臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準
根據《臨床檢驗擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》,制定本標準
一、臨床基因擴增檢驗實驗室區域設置原則
(一)臨床基因擴增檢驗實驗室區域設置原則
1、試劑儲存和準備區
2、標本制備區
3、擴增反應混合物配制和擴增區
4、擴增產物分析區
如使用全自動分析儀,區域可適當合并。
(二)各工作區域必須有明確的標記,避免不同工作區域內的設備、物品混用。
(三)進入各工作區域必須嚴格按照單一方向進行,即試劑儲存和準備區―>標本制備區―>擴增反應混合物配制和擴增區―>擴增產物分析區。
(四)不同的工作區域使用不同的工作服(例如不同的顏色)。工作人員離開各工作區域時,不得將工作服帶出。
二、工作區域儀器設備配置標準
(一)試劑儲存和準備區
1、2-8C和-15C冰箱
2、混勻器
3、微量加樣器(覆蓋1-1000ul)
4、移動紫外燈(近工作臺面)
5、消耗品:一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾心)
6、專用工作服和工作鞋
7、專用辦公用品
(二)標本制備區
1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱
2、高速臺式冷凍離心機
3、混允器
4、水浴箱或加熱模塊
5、微量加樣器(覆蓋1-1000ul)
6、可移動紫外燈(近工作臺面)
7、超凈工作臺
8、消耗品:一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾心)
9、專用工作服和工作鞋
10、專用辦公用品
如需處理大分子DNA,應具有超聲波水浴儀。
(三)擴增反應混合物配制和擴增區
1、核酸擴增儀
2、微量加樣器(覆蓋1-1000ul)
3、可移動紫外燈(近工作臺面)
4、消耗品:一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾心)
5、專用工作服和工作鞋
6、專用辦公用品
(四)擴增產物分析區
視檢驗方法不同而定?;緝x器設備如下:
1、微量加樣器(覆蓋1-1000ul)
2、可移動紫外燈(近工作臺面)
3、消耗品:一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭(帶濾心)
4、專用工作服和工作鞋
5、專用辦公用品

 

臨床基因擴增檢驗實驗室工作規范

為使基因擴增檢驗技術有效地應用于臨床,更好地為疾病的預防、診斷和治療服務,保證檢驗質量,特制定本規范。

一、臨床基因擴增檢驗實驗室的規范化設置及其管理

臨床基因擴增檢驗實驗室的規范化設置詳見《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》(衛醫發[2002]10號文)附件《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》。為避免污染,必須嚴格遵循《臨床基因擴增檢驗實驗室設置標準》設置臨床基因擴增檢驗實驗室。

臨床基因擴增檢驗實驗室四個隔開的工作區域中每一區域都須有專用的儀器設備。各區域都必須有明確的標記,以避免設備物品如加樣器或試劑等從其各自的區域內移出從而造成不同的工作區域間設備物品發生混淆。進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向順序,即只能從試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制和擴增區(簡稱擴增區)至產物分析區,避免發生交叉污染。在不同的工作區域應使用不同顏色或有明顯區別標志的工作服,以便于鑒別。此外,當工作者離開工作區時,不得將各區特定的工作服帶出。

清潔方法不當也是污染發生的一個主要原因,因此實驗室的清潔應按試劑貯存和準備區至擴增產物分析區的方向進行。不同的實驗區域應有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

(一)試劑貯存和準備區

下述操作在該區進行:貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。

貯存試劑和用于標本制備的材料應直接運送至試劑貯存和準備區,不能經過產物分析區。在打開含有反應混合液的離心管或試管前,應將其快速離心數秒。試劑原材料必須貯存在本區內,并在本區內制備成所需的貯存試劑。當貯存試劑溶液經檢查可用后,應將其分裝貯存備用,避免由于經常打開反應管吸液而造成污染。

含反應混合液的離心管或試管在冰凍前都應快速離心數秒。大多數用于擴增的試劑都應冰凍貯存。為避免因單次反應取液而頻繁的凍融主貯存試劑,應分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據通常在實驗室內一次測定所需的擴增反應數來決定。

主反應混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩定性通過預試驗來檢查,評價結果必須有書面報告。對于"熱啟動"技術(在第一個高溫變性步驟后加入酶),聚合酶也可不包含在主反應混合液中。

在整個本區的實驗操作過程中,操作者必須戴手套,并經常更換。此外,操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。

嚴禁用嘴吸取液體,加樣器和吸頭等必須經高壓處理。

工作結束后必須立即對工作區進行清潔。本工作區的實驗臺表面應可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關鍵,因此可使用可移動紫外燈(254nm波長),在工作完成后調至實驗臺上60~90cm內照射。由于擴增產物僅幾百bp,對紫外線損傷不敏感,因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間,最好是照射過夜。實驗室及其設備的使用必須有日常記錄。

(二)標本制備區

下述操作在該區進行:臨床標本的保存,核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。

要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的污染,所以應避免在本區內不必要的走動??赏ㄟ^在本區內設立正壓條件避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染,加入待測核酸后,必須蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危險性的材料,必須有明確的樣本處理和滅活程序。

用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒(例如含次氯酸鈉溶液)容器內。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔,實驗材料(原始血標本、血清標本、提取中的標本與試劑的混合液等)如出現外濺,則必須分別處理并作出記錄。

對實驗臺適當的紫外照射(254nm波長,與工作臺面近距離)適合于滅活去污染??梢苿幼贤饩€管燈可用來確保工作后對實驗臺面的充分照射。

樣本處理對核酸擴增有很大影響,必須使用有效的核酸提取方法,可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價。

用于RNA擴增檢測的樣本制備好以后,應立即進行cDNA合成,因為cDNA鏈較RNA穩定,保存相對容易。為保證逆轉錄反應的需要,應在標本制備區設置一個以上的溫育裝置。

cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定,傾向于使用一步法:即使用在擴增反應緩沖液條件下具有逆轉錄活性的熱穩定的DNA聚合酶進行逆轉錄,其較cDNA合成后再開蓋以調節緩沖液或加入聚合酶進行擴增發生污染的可能性降低。

待測RNA的cDNA拷貝須保存在標本制備區,不得在本區對樣本進行PCR擴增。

(三)擴增區

下述工作在本區內進行:DNA或cDNA擴增。此外,已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區)的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區)制備成反應混合液等也可在本區內進行。在巢式PCR測定中,通常在第一輪擴增后必須打開反應管,因此巢式擴增有較高的污染危險性,第二次加樣必須在本區內進行。

不能從本區再進入任何"上游"區域,可降低本區的氣壓以避免氣溶膠從本區漏出。

為避免氣溶膠所致的污染,應盡量減少在本區內的走動。如有加樣則應在超凈臺內進行。打開預處理過的反應混合液時必須防止液體濺出,尤其是在巢式擴增步驟之間。一個簡單的方法是在打開反應管前快速離心數秒??墒褂皿w積較小的離心機,因其所占實驗臺面小,易于用一只手操作,適合于大多數超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用,但必須注意的是,礦物油本身也可能成為一種持續性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。

完成操作及每天工作后都必須對實驗室臺面進行清潔和消毒,紫外照射方法與前面區域相同。如有溶液濺出,必須處理并作出記錄。

(四)擴增產物分析區

下述操作在本區內進行:擴增片段的測定。

核酸擴增后產物的分析方法多種多樣,如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標記或非同位素標記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉移、核酸測序方法等。目前國內的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標記的微孔板上探針雜交方法,即PCR-ELISA方法,也有膜上探針雜交方法。

本區是最主要的擴增產物污染來源,因此必須注意避免通過本區的物品及工作服將擴增產物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產物時,必須使用洗板機洗板,廢液必須收集至1mol/L HC1中,并且不能在實驗室內傾倒,而應至遠離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理,如焚燒。

由于本區有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等,故應注意實驗人員的安全防護。

本區的清潔消毒和紫外照射方法同前面區域。本區如采用負壓條件或減壓情況下(如安裝排風扇)可減少擴增產物從本區擴散至前面區域的可能性。

二、臨床基因擴增檢驗實驗室質量保證

臨床基因擴增檢驗實驗室質量保證涉及到整個基因擴增檢驗的所有階段,即測定分析前的標本采集處理、測定中的核酸提取、擴增和產物分析以及測定后的結果報告等。

(一)標本的采集

常用于基因擴增檢測的臨床標本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時,應使用一次性密閉容器,如真空采血管。當使用非密閉采樣系統時,如尿、分泌物和骨髓的采樣,必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時必須戴一次性手套。
玻璃器皿在使用前應高壓處理,因為玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是熱滅菌,250℃烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。

全血和骨髓標本必須進行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝,因為肝素是Taq酶的強抑制劑,而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。參考潔凈室http://www.iwuchen.com/

臨床用于RNA(如HCV RNA)擴增檢測的血標本建議進行抗凝處理,并盡快(3小時以內)分離血漿,以避免RNA的降解。如未作抗凝處理,則抽血后,必須在1小時內分離血清。

(二)標本的穩定化處理

用于DNA擴增檢測的標本,采集后一般不需要特殊的穩定化處理,但標本應及時送至實驗室。

由于RNA易受RNA酶的降解,因此用于RNA測定的標本有時必須進行穩定化處理,如流行病學調查的現場采樣。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活,因此在采集標本時,可將標本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中,從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。經上述穩定化處理后,標本一般不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項目,上述穩定化處理方法的效果究竟如何,要使用相應的逆轉錄PCR測定方法來評價。

(三)標本的運送

標本采集后必須盡快送至實驗室。經過適當穩定化處理的標本可在常溫下通過郵寄運送。如用于DNA擴增檢測的EDTA抗凝全血標本及用于RNA擴增檢測的經GITC穩定化處理的標本。通常在運送時,應采用不易破碎的容器裝載標本。用于RNA檢測的標本,如果未經穩定化處理,則必須速凍后,放在干冰中運送。

(四)標本的貯存

臨床體液標本如血清/血漿等可于-70℃下長時間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA緩沖液(pH 7.5-8.0)中4℃保存。用于RNA測定的已純化核酸樣本應在緩沖液中-80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20℃即可。用GITC處理的RNA標本在室溫可保存7天。

(五)標本的處理(核酸提取)

標本處理即核酸提取純化是決定擴增檢測成敗的關鍵性步驟,在使用商品核酸提取試劑提取臨床標本中的核酸模板前,應對其進行充分評價以驗證其提取的有效性。通常,核酸制備質量不高是由于抑制物去除不完全所致,抑制物可能來源于標本本身(如血紅素及其前體或降解產物)或核酸提取過程中殘留的有機溶劑(如酚、氯仿等),這些物質對其后的Taq酶擴增反應步驟具有強烈的抑制作用,從而影響靶核酸的擴增測定。當標本為痰時,則必須先進行液化處理,再提取核酸。需注意的是,液化時不能加熱,液化時間不能過長。此外,當靶核酸為RNA時,逆轉錄PCR測定失敗的常見原因是標本在運送前未經充分的穩定化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污染。對于前者,要核查測定分析前的步驟,如果發現有RNA降解的證據,實驗室則應拒絕接受標本,要求重新采取標本,并對運送者給以詳細的指導。對于后者,建議使用高質量的商品核酸提取試劑。

(六)靶核酸的逆轉錄(RT)和擴增

1、靶RNA的逆轉錄

cDNA合成為逆轉錄PCR中的第一個酶反應步驟,所產生的cDNA為靶RNA的反向互補鏈,為后面擴增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率:(1)逆轉錄效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆轉錄酶質量不高、試劑降解變質或加樣錯誤等;(2)用于逆轉錄的標本中存在逆轉錄或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血紅素等);(3)RNA酶的存在導致RNA的降解。

2、核酸的擴增

有多種因素可引起核酸擴增檢測的假陽性或假陰性結果,如擴增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對、Mg 濃度不佳、患者標本或試劑受污染等。擴增儀孔中熱傳導的均一性極為重要,必須定期對擴增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導的一致性進行檢查,以避免假陰性結果。

(七)污染

在實際工作中,常見有以下幾種污染類型:擴增片段的污染(產物污染);天然基因組DNA的污染、試劑污染(貯存液或工作液)以及標本間交叉污染(如氣溶膠從一個陽性標本擴散到原本陰性的標本)。臨床基因擴增檢驗實驗室中污染的最主要來源是擴增產物的污染。

由于一旦發生污染后,再圍繞實驗室來尋找污染源不僅耗時而且還很繁瑣,所以防止污染重在預防。但如果發生了污染,實驗就必須停止,直到發現了污染源為止,并且實驗結果必須作廢。

1、測定分析前的污染源

測定分析前實驗材料的污染主要來自非病人標本來源的核酸。

2、測定分析階段的污染源

通常,測定分析階段的每一步都可能發生對樣本的污染。反應混合液的任何成分及核酸的制備和反應建立階段所涉及到的實驗設備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑(例如牛血清白蛋白,明膠或礦物油)、商品酶制劑、消耗品(如反應管,吸頭)和實驗設備(如加樣器、離心機)等。

在前面三個工作區中,不當的實驗操作會引起所使用的試劑、消耗品或實驗設備的污染。而在產物分析區,當吸取擴增產物用于檢測時,非常容易引起污染,因此必須制定標準操作程序(SOP),并嚴格執行。

3、污染的避免

要避免污染,首先應是預防而不是排除污染,前面所述對工作區的嚴格劃分的目的即是為了預防污染。

為避免以前測定中所產生的擴增產物的污染,可設法將其破壞掉。如在擴增反應中用dUTP取代部分dTTP,使得產生的特異擴增片段含有尿嘧啶,這樣擴增前在反應混合液中加入尿嘧啶糖苷酶(UNG),可破壞來自以前測定的擴增產物,從而避免其對以后要進行的擴增測定的污染。另外一種方法是持續的長波紫外燈照射,通過異補骨脂素光化學產生DNA加合物,由于DNA加合物對擴增沒有反應但又不妨礙PCR后雜交過程,所以這種方法也能防止污染。

上述防污染方法只在一定程度上有效,所以不能用其來替代嚴格的實驗室設置和管理,尤其是這些方法不能防止外來非擴增的天然DNA的污染。

4、去除污染的措施

工作完后必須定期對實驗室采取有效的去污染措施,結合各種不同的方法可達到最佳效果。去污染措施包括但不僅限下面幾種:(1)用10%(v/v)次氯酸鈉清潔表面;(2)試驗后長時間的紫外照射實驗操作臺面和其他表面;(3)實驗設備如加樣器的高壓消毒。

(八)擴增產物的分析

擴增產物的測定有各種方法,如電泳、限制性酶切、斑點印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等,但臨床PCR檢驗項目基本上都使用探針雜交方法。

雜交結果不充分的原因可能是基因探針不合適、標記方法不對、對探針的標記不夠、雜交或洗滌方法不合適等。

最常使用的基因探針有:DNA片段、合成的寡核苷酸和體外轉錄的反義RNA探針。探針的標記物常用的有生物素、地高辛、熒光素和同位素等。

在擴增后的雜交檢測中,應該嚴格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。溫度太低或離子強度太高都會降低雜交的嚴格性,還會給檢測信號的特異性帶來負面影響。相反,提高溫度和/或降低離子強度會增加雜交的嚴格性。因此,嚴密控制溫度和試劑的離子強度是避免假陽性和假陰性結果的先決條件。要注意的是,溫度和離子強度不能同時改變。

(九)質量控制

質量控制包括兩個方面,即室內質量控制(以下簡稱質控)和室間質量評價。

1、室內質量控制

必須對DNA和RNA分析的各步進行質量控制,以避免假陽性和假陰性,保證測定結果的準確性和重復性。由于核酸擴增測定的高敏感性,所以標本制備、逆轉錄、擴增本身和產物分析中的每一步都要求有質控措施。

(1)標本制備:

常用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA提取效果,以判斷所提取的DNA是否發生降解。用常規的手工提取方法制備的DNA的平均長度一般為~100kb,用適合PCR的DNA提取試劑盒制備的DNA的長度平均范圍為30-40kb。明顯出現降解的DNA(在1和10kb的低分子量范圍內)在經瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見強的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內切酶(如EcoRI)消化DNA,然后電泳分離,能夠對酶活性的抑制劑進行質控(在抑制劑存在的情況下,高分子量的片段不被酶切)。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測定來估計,質量好的DNA提取物,A260/A280比值應該在1.75~2.0之間;否則,殘留的蛋白或酚可能會很高。僅用光度計比色方法不能對DNA的完整性下結論。

最快的對總RNA提取質量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳,這一點跟DNA分離相同。但如果對結果有疑問,就應該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。在理想情況下,三種主要的核糖體RNA(28S、18S和5S)在凝膠上出現的帶相對較窄。如發生RNA的降解,則出現大量低分子量帶或出現帶的消失。測定核糖體RNA帶的密度指數可作為對RNA制備的質量評價的實驗室內的標準;對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的合適的指標。另外,瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因,單獨的光度計比色方法也不能對RNA的完整性下結論。

對于血清(漿)中病毒的測定,則要評價標本出現溶血、脂血和黃膽情況下標本處理方法對擴增檢測的影響,避免由于標本處理方法的不當而出現假陰性結果。此外,還可采用已知濃度標本評價核酸提取方法的效果。

(2)逆轉錄和擴增:本部份包括陽性質控和陰性質控。

對逆轉錄和核酸擴增的質控既可使用內標質控方法也可采用外標質控方法。逆轉錄-擴增檢測的內標通常為在整個細胞周期中均勻表達的mRNA,如HLA、β肌動蛋白和組蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。此外,也可在標本制備時將外來內標加入到樣本中共同提取、逆轉錄及擴增。當標本中存在逆轉錄抑制物,或核酸提取中發生RNA降解,或逆轉錄酶失活,內標即會表現為陰性結果。
對于DNA測定內標可使用對有機體存活所必須的靶基因,如維生素D血漿結合蛋白的基因。對于病原體的基因檢測,內標多采用人工制備的競爭性內標。內標可以監控每一擴增孔中假陰性的產生情況。

目前的商品試劑盒大部分沒采用內標方法質控。因此在測定血清/血漿病原體核酸如HBV DNA、HCV RNA等時,應使用已知的弱陽性血清/血漿作為質控樣本,與待測臨床標本等同處理提取核酸及擴增,以判斷逆轉錄及擴增檢測的效果。

使用這些外加弱陽性質控不但可檢測擴增反應液的質量,還可獲得有關PCR試劑的檢測下限和特異性的信息。這些質控樣本在擴增檢測時必須使用與患者的標本相同的主反應混合液。

每一個PCR實驗中都必須設有外加陰性質控(污染監測質控),為判斷擴增過程中污染出現的階段,陰性質控可包括如下幾種,即在樣品制備的整個過程中所帶的空白管、僅有擴增反應液但不含擴增模板的反應管、陰性標本等。陰性標本可以評估PCR實驗的綜合質量。

在擴增靶RNA的RT-PCR實驗中,可做省略逆轉錄的污染質控,通過這種方法,可發現以前擴增的DNA片段所引起的污染。

(3)板上雜交和膜上斑點印跡雜交的質控:在板上雜交和斑點雜交時,陽性和陰性質控應該在同一板或膜上與病人標本平行進行分析,這可排除不同反應中因使用不同雜交條件所致的對結果的錯誤解釋。

(4)測定結果的評價與報告:采用實時熒光定量PCR檢測方法,在判斷結果時,應先對擴增的熒光信號作出定性判斷,然后再進行定量分析,避免一些非特異熒光信號對結果分析的干擾。

結果的報告必須簡單清楚。定性測定報告"陽性"或"陰性"即可。定量測定則必須報告量的多少,如結果高于測定方法線性范圍上限,則對樣本稀釋后再測,結果乘上稀釋倍數;如結果低于方法的測定范圍下限,則報?lt;多少即可,不能報告為"0"或"陰性"。

2、室間質量評價

所有開展臨床基因擴增檢驗的實驗室都必須參加由衛生部臨床檢驗中心組織的全國臨床基因擴增檢驗項目的室間質量評價,評價結果將作為其開展臨床基因擴增檢驗的依據之一。

本工作規范自公布之日起實施。

 

如何迎接臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收

   臨床基因擴增檢驗實驗室主要應用把PCR(聚合酶鏈反應)技術應用于疾病的診斷與治療監測。PCR技術發明是生物醫學領域的一項革命性創舉,具有深遠歷史意義,但在上世紀九十年代中國,在我國由于部分醫部機構受利益的驅動,在缺乏技術、設備以及規范化管理的情況下,PCR技術臨床應用泛濫,出現大量假陽性和假陰性結果,甚至出現虛假檢測報告,造成檢驗結果和臨床意義應用十分混亂,嚴重擾亂正常醫療秩序,特別在性病基因檢測方面,甚至還帶來一系列道德倫理、家庭糾紛以及社會和法律問題。PCR技術臨床應用所出現的一系列問題引起衛生部管理層高度重視,衛生部醫政司于1988年下發了衛醫發[1998]9號文件宣布PCR技術暫停應用于臨床診斷。經過近四年反復論證,衛生部2002年1月14日發布“臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法”,同年2月20日衛生部臨床檢驗中心發布“臨床基因擴增實驗室工作規范”。兩個文件宣布了PCR技術臨床應用解凍,明確規定臨床基因擴增檢驗實驗室開展PCR技術必需具備的基本條件:①規范的PCR實驗室②編寫適合本實驗室的質量手冊③經PCR專業知識培訓的技術人員(PCR上崗證)④使用有生產批文的PCR試劑。具備條件的二級以上醫院可向衛生部或省臨床檢驗中心申請技術驗收。

   本人作為通過衛生部臨床檢驗中心驗收的臨床基因擴增檢驗實驗室一名實驗室工作人員,同時也作為專家多次參與衛生部臨床檢驗中心組織的實驗室驗收,就臨床基因擴增實驗室技術驗收的前期準備工作和現場技術驗收整個過程作一簡單介紹,并談談本人體會。
一、為什么要進行臨床基因擴增檢驗實驗室技術增收
   臨床基因擴增實驗室采用PCR技術用于臨床基因診斷,由于PCR技術對所檢測的核酸模板進行大量擴增,容易出現實驗室污染導致臨床檢測標本假陽性結果;另外由于PCR技術要求高、影響因素多(特別是RNA標本),實驗過程處理不當易導致核酸模板無擴增現象,導致臨床標本假陰性結果。因此臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收和規范化管理是PCR技術本身需要,也是在臨床上順利應用該技術前提。
二、PCR實驗室驗收準備工作
(一)硬件準備――實驗室基本建設
1.根據文件要求,臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區域:試劑貯存和準備區;標本制備區;擴增反應混合物配制和擴增區;擴增產物分析區,如使用全自動封閉分析儀器檢測,此區域可不設。
2.各工作區域必須有明確的標記,避免不同工作區域內的設備、物品混用。
3.進入各工作區域必須嚴格按照單一流向進行,即試劑貯存和準備區→標本制備區→擴增反應混合物配制和擴增區→擴增產物分析區。
4.不同的工作區域使用不同的工作服(不同的顏色)。工作人員離開各工作區域時,不得將工作服帶出。
5.工作區域儀器設備配置標準
(1)試劑貯存和準備區
    2~8℃和-15℃冰箱:混勻器;微量加樣器(覆蓋1~1000μl);移動紫外燈(近工作臺面);消耗品:一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾心);專用工作服和工作鞋;專用辦公用品等。
(2)標本制備區
    2~8℃冰箱,-20℃或-80℃冰箱;高速臺式冷凍離心機;混勻器;水浴箱或加熱模塊;微量加樣器(覆蓋1~1000μl);可移動紫外燈(近工作臺面);超凈工作臺,消耗品;一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾心);專用工作服和工作鞋;專用辦公用品等。
(3)擴增反應混合物配制和擴增區
   核酸擴增儀;微量加樣器(覆蓋1~1000μl);可移動紫外燈(近工作臺面);消耗品:一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾心);專用工作服和工作鞋;專用辦公用品等。
(4)擴增產物分析區
   視檢測方法不同而定?;緝x器設備如下:微量加樣器(覆蓋1~200μl);可移動紫外燈(近工作臺面);消耗品:一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾心);專用工作服和工作鞋;專用辦公用品等。
(二)軟件建設――質量手冊編寫與實施、人才資源(上崗證培訓與相關知識學習)
1.臨床基因擴增檢驗實驗室的質量手冊編寫
   質量手冊是闡明臨床基因擴增檢驗實驗室的質量方針,并描述過其質量體系的文件。質量手冊規定了質量體系的基本結構,是實施和保持質量體系應長期遵循的文件。臨床基因擴增檢驗實驗室質量手冊編寫應依照衛生部下發兩個文件,并結合本實驗室實際情況編寫適合本實驗室的切實可行的質量手冊。質量手冊的提綱應包括三部分:質量方針和宗旨;工作制度;標準操作文件(SOP)
(1)質量方針和宗旨
   制定臨床基因擴增檢驗實驗室的質量管理目標和質量保證體系的結構體系和總方針。
(2)工作制度
   一般應包括以下文件:實驗室的設置、布局及組織結構;實驗室內務管理制度;實驗室的人員配置及管理制度;生物的防護與安全制度;實驗室廢棄物處理制度;實驗室清潔消毒制度;儀器設備的管理制度;儀器、試劑、耗材購置程序及管理制度;臨床標本的管理制度;實驗室記錄的管理制度;質量控制工作管理制度;結果報告管理制度;抱怨的內部處理制度;負責人及質檢員職責;崗位設置和責任制等……
(3)標準操作程序(SOP)
   一般包括:消毒液配制標準操作程序:消毒標準操作程序;超凈工作臺使用標準操作程序;超凈工作臺維護和保養標準操作文件;PCR儀使用標準操作程序;PCR儀維護和保養標準操作程序;高速低溫離心機使用標準操作程序;移液器使用標準操作程序;冰箱維護和保養標準操作程序;電熱恒溫水浴箱操作程序;電子天平使用和校正操作程序;可移動紫外消毒車使用操作程序;加樣器校準標準操作程序;離心機維護保養操作程序;溫度計校準程序;試劑的質檢操作程序;標本唯一標識編號編制規則;臨床標本的采集及處理操作程序;臨床標本的保存程序;乙肝病毒核酸擴增熒光檢測標準操作程序;丙肝病毒核酸擴增熒光檢測標準操作程序;結核分枝桿菌核酸擴增熒光檢測標準操作程序;沙眼衣原體核酸擴增熒光檢測標準操作程序等……
(4)引用圖表:PCR擴增可接受標本記錄表;PCR擴增拒收標本記錄表;室內質控結果記錄表;室間質控記錄表;消耗性材料驗收記錄表;試劑驗收記錄表;故障處理表;臺階式高速離心機使用記錄表;臺式高速冷凍離心機使用記錄表;擴增儀維護保養記錄表;人員培訓計劃及培訓記錄表;實驗室工作人員一覽表;主要設備一覽表;實驗室清潔消毒記錄表;工作區溫度、濕度記錄表;抱怨記錄表;標本超低溫保存記錄表;應急處理記錄表;垃圾處理記錄表;冰箱溫度記錄表;水浴箱溫度記錄表;移動紫外消毒車記錄表;設備校正記錄表;檢測結果報告流程;報告單樣張;臨床送檢標本流程圖;實驗室組織結構圖。
三、臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收申請
(1)填寫臨床擴增檢驗實驗室技術驗收申請表
(a)基因擴增檢驗實驗室基本情況
   包括檢驗科基本情況特別是基因擴增檢驗實驗室基本運行情況,必要性與可行性,著重分析開展項目運行情況、人員配置現狀、內部質量管理體系執行情況與效果分析。
(b)應提供資料
醫療機構執業許可證;
   擬設置基因擴增檢驗實驗室醫院的醫療衛生資源狀況、對臨床基因擴增檢驗的需求情況以及實驗室運行的預測分析;
   擬設基因擴增檢驗實驗室的設置平面圖;
   實驗室主要負責人簡歷表;
   實驗室工作人員一覽表(附實驗室工作人員簡歷);
   主要儀器設備表;
   擬開展的臨床基因診斷項目;
   臨床基因診斷質量手冊;
   檢驗報告單2份。
(c)希望驗收時間
   根據本實驗室建設進展情況和試運行進展,提出大致的現場技術驗收時間。
(d)聲明
   志愿申請,承擔兩義務:遵守《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》和《臨床基因診斷實驗室工作規范》及有關規定;不論能否獲準通過驗收,預付驗收階段的全部費用。
(2)衛生部或省臨床檢驗中心預審
   對申報文件和現場進行預驗收,初步確定是否進行現場驗收和驗收時間。
四、現場技術驗收
衛生部臨床檢驗中心臨床基因擴增檢驗實驗室技術任務書現場技術專家組成員組成
技術驗收工作日程表
驗收組預備會
首次會議
現場驗收
實驗室設置及儀器設備配備情況
實驗室標準操作程序文件
有關記錄
現場考核
現場試驗
驗收組全體會議
擬定驗收結論和驗收報告
末次會議
驗收組宣布驗收結論
實驗室負責人講話
5.臨床基因擴增檢驗實驗室驗收體會
(1)對驗收文件的學習不夠、理解不深,導致編制程序性文件偏離,應對照驗收要求逐條落實,切實可行。
(2)目的性認識不足:
   受老觀念的影響,總以為實驗室技術驗收準備工作是為專家而準備的,沒意識到這是本實驗室檢驗質量的內在需要,以為只要通過專家現場驗收,拿到合格證書就萬事大吉了。
(3)質量控制意識不強
   我們編寫的質量手冊的目的是規范實驗操作整個過程,做到實驗過程有章可循,實驗記錄有據可查,保證實驗結果的可靠性和準確性。由于基因擴增技術特殊性,即使嚴格按質量手冊進行操作,也難免出現錯誤結果,因此還應該強化質量控制意識。實驗過程中嚴格設置質控標本,包括試劑空白對照、陰性標本對照、臨界值陽性標本對照等,分別監測試劑配制與加樣過程中是否存在污染?標本核酸模板提取過程中是否存在污染?標本檢測過程中是否存在假陰性結果和結果是否準確?等。但有些醫院由于考慮到各種實際問題而沒有很好落實,應引起高度重視。
(4)程序文件實施難問題
   在許多醫院,由于基因擴增檢驗實驗室是目前大多檢驗科唯一通過實驗室技術驗收的實驗室,可能受周邊其他實驗室不規范行為的干擾和存在人員配備方面問題,可能出現文件落實方面問題,特別是原始標本的接收和記錄方面。
(5)工作量少影響質量保證體系實施
   嚴格按臨床基因擴增檢驗實驗室技術要求通過驗收的實驗室,存在一定運行成本,需要有一定臨床標本量的支持;如果某一醫院醫療資源不足,標本來源不足以支持運行成本時,就會想方設法去減少運行成本(包括試劑成本和勞務成本),導致檢驗質量難以得到保證。因此建議欲建立臨床基因擴增檢驗實驗室的單位,應充分考慮自己醫療資源情況,確定是自己建立臨床基因擴增檢驗實驗室合算?還是外送標本合算?。同時衛生部和省臨床檢驗中心在初審應充分考慮這方面情況,以及現場驗收專家應嚴加把關。

 

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